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ELISA實驗出現(xiàn)“花板"現(xiàn)象大探秘 !
酶聯(lián)免疫吸附試驗 ELISA(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)其原理是抗原或抗體的固相化及抗原抗體的酶標記。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進行定性或定量分析。該實驗因其靈敏度較高，特異性較好，操作較簡單，可大批量操作而廣泛應用于多種傳染性疾病的篩查工作中。然而，“花板"現(xiàn)象的出現(xiàn)，往往會給實驗者判讀結(jié)果帶來麻煩。所謂“花板"，就是空白、陰性、陽性對照及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常，而標本孔的OD值卻偏高，弱陽性結(jié)果較多。筆者對“花板"現(xiàn)象進行了分析和總結(jié)，認為花板原因大多在樣品，解決辦法主要在洗滌，孵育和顯色過程也會導致。
1、花板原因大多在樣品
所謂“花板"，就是空白、陰陽性對照及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常，而標本孔的OD值卻偏高。之所以空白、對照及質(zhì)控結(jié)果正常而標本孔異常，是因為樣品本身的原因，大部分或全部標本孔的OD值偏高，很可能是因為樣品中某些共有的物質(zhì)非特異性的吸附于固相載體，而在實驗的過程中未被除去。
1.1、 待測血清中混有紅細胞或纖維蛋白原 這兩種物質(zhì)易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈，實驗表明在較高的離心轉(zhuǎn)速(3000 /min)和較長的離心時間(>10 min)之下，血液標本被充分地離心分離之后，使紅細胞和纖維蛋白充分沉淀，可以在加樣時避免加入紅細胞和纖維蛋白，避免這兩種干擾物質(zhì)對實驗結(jié)果的影響，就可避免“花板"情況。
1.2、 高IgG血癥 在實際工作中，檢測丙肝的實驗出現(xiàn)花板的情況較多，原因之一是因為目國內(nèi)外的抗-HCV EIA試劑均采用間接酶聯(lián)免疫檢測原理，間接法的一個重要影響因素是血清中所含的高濃度的非特異性IgG，IgG對聚苯乙烯有較強的吸附力，非特異性IgG可吸附到固相載體上或包被的抗原上造成假陽性。
2、解決辦法主要在洗滌
聚苯乙烯因其具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能而被廣泛用于ELISA實驗的固相載體，聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，因此需要通過洗滌清除在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。洗滌在 ELISA 過程中雖不是一個反應步驟，但卻決定著實驗的成敗。上述提到的血清中存在紅細胞或纖維蛋白原，可以在加樣離心時得到控制，同樣也可以通過適當增加洗滌次數(shù)和浸泡時間減輕或避免對實驗結(jié)果的影響，同樣，對于血液存在的非特異性的IgG,實驗者很難在加樣時將其去除，那么解決的時機就是洗滌過程。
ELISA在洗滌過程中需注意以下幾點：
(1)、板要平整，尤其是在用洗板機洗板的過程中，往往是3排一起洗，如果板不平，就很可能造成洗液有殘留，從而導致非特異性結(jié)合不能清除干凈，對實驗結(jié)果造成干擾。
(2)、洗液溫度，實驗表明，洗液溫度也會影響洗板的干凈程度，尤其是冬天溫度過低時容易出現(xiàn)“花板"問題。因此，保持室溫在20℃-30℃。
(3)、洗液要注滿孔，孔壁洗滌不干凈也易造成“花板"現(xiàn)象。
(4)、洗液要新鮮配置，洗液要臨用新鮮配制，放置時間過長易產(chǎn)生絮狀物或混濁，造成賭孔或花板。
(5)、洗板次數(shù)不夠或洗滌間隔時間過短也會造成由于洗板不凈而造成“花板"。
3、孵育時間過長也會造成“花板"
實驗室有一段時間經(jīng)常出現(xiàn)丙肝檢測“花板"現(xiàn)象，究其原因是由于樣本較多，加樣后未及時放入孵育箱，反應板在室溫呆的時間過長，即間接增加了孵育時間，導致孵育時間過長，蛋白質(zhì)非特異性吸附于固相載體。因此，應嚴格控制加樣時間，加樣后及時孵育，標本較多時可分批操作。
此外，有些廠家的試劑顯色液不穩(wěn)定，使用容易變藍，如在實驗不仔細檢查，很容易導致“花板"現(xiàn)象的發(fā)生，這也提醒實驗者應使用新鮮的顯色液，程度的實驗的準確性。
綜上所述，將ELISA“花板"現(xiàn)象總結(jié)為：花板原因大多在樣品，解決辦法主要在洗滌，孵育和顯色過程也會導致。既然原因大多在樣品，那么在樣品交接時應嚴格按照規(guī)定，無溶血，無凝血，足量，單個的溶血樣品雖不致造成“花板"，但血紅蛋白中的血紅素基團，具有類過氧化物的活性，在以辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)為標記酶的ELISA測定中，易在孵育過程中吸附于固相，從而與后面加入的底物反應顯色，從而造成假陽性。洗滌是ELISA的關(guān)鍵步驟，充分有效的洗滌也是避免“花板"的有利措施。同樣，嚴格按照試劑說明孵育，使用新鮮的顯色液也是有效避免“花板"的保障。以上措施可以有效減少“花板"次數(shù)，從而提高檢測的特異性和準確性，更好的發(fā)揮ELISA的方法學優(yōu)勢。
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